无细胞蛋白表达ALiCE^®试剂盒常见问题解答

#耗材储运

1. 如果需要，我可以要求更多的ALiCE^®管和盖子吗？

• 可以直接从我们的供应商Sarstedt订购更多的管子和瓶盖（管子的产品编号为72.730.711，瓶盖的产品编号为65.716.727）。瓶盖需要使用带有适当规格的注射器针头穿孔。

2. 如何运送ALiCE^®试剂盒？

• ALiCE^®是用干冰运输的。如果收到您的包裹后所有干冰都已升华，请立即与我们联系。

3. 我应该如何储存ALiCE^®反应混合物和对照质粒？

• ALiCE^®反应混合物应立即转移到-80°C。 在任何情况下，请不要使用液氮快速冷冻混合物。将冻融周期保持在绝对最低限度。对照质粒（pALiCE01和pALiCE02）应储存在-20°C。

4 . ALiCE^®裂解物的性能是否存在批次间差异？

• 我们对每批裂解物进行大量的质量控制检查，并保证参比蛋白eYFP的表达水平至少为2 mg/mL。这些检查涵盖了各种不同类别（生物物理、生物化学、工艺特定）的参数。此外，微粒体表达的蛋白质也具高度可重复性。

#表达反应

1. 推荐哪种载体来表达需要复杂翻译后修饰（如N-糖基化或二硫键）的蛋白质？

• 需要翻译后修饰的蛋白质应靶向ALiCE^®反应混合物中存在的微粒体。这可以通过将您的目的基因克隆到含有蜜蜂蜂毒信号肽（Melittin Signal Peptide，MSP）的pALiCE02载体中来实现。

2. 是否可以在ALiCE^®反应中添加酶的辅助因子？

• ALiCE^®是一种复杂的裂解物，含有我们专有的Master Mix溶液，可实现最佳表达条件。在不干扰转录/翻译过程的情况下，可以添加特定的辅助因子。其中一些辅助因子可能已经存在于混合物中，在进行酶测定时应予以考虑。请联系我们的团队了解更多具体细节。

3. 您建议采用哪种实验装置来运行毫升级反应？

• 联系我们，以了解毫升和更大体积反应的详细信息

4. 是否可以在ALiCE^®中表达需要二硫键的蛋白质？

• 是的，二硫键是在我们裂解物中所含的微粒体中形成的。pALiCE02 在目的基因的克隆位点上游含有一个蜂蛋白信号肽序列。这会将您的蛋白质靶向到微粒体进行处理。

5. 用于ALiCE^®的质粒浓度多少合适？

• 为避免稀释ALiCE^®反应混合物，我们建议质粒DNA的浓度至少在200 ng/μL。在比较不同DNA浓度以获得最佳表达条件时，必须考虑稀释因子。质粒DNA的建议最终浓度为5 nM，用于蛋白质特异性测试的浓度范围为2.5-20 nM。

#蛋白分析

6. 如何检查我的蛋白质是否已表达？

• pALiCE01 和 pALiCE02 载体包含链球菌标签。因此，您可以使用抗链球菌 HRP 偶联抗体通过蛋白质印迹法检查目标蛋白的表达。

7. 是否有推荐的缓冲液用于稀释ALiCE^®裂解物，例如SDS-PAGE分析？

• 您可以使用任何您选择的缓冲系统，只要它的pH值范围在7.0-7.4之间，因为这样可以实现最佳的蛋白质活性。建议缓冲液浓度范围为 10 mM至50 mM。较高浓度的缓冲液可能会干扰SDS-PAGE，应避免使用。

8. 是否可以在不进行DDM处理的情况下分析靶向微粒体 （pALiCE02） 的目标蛋白？

• 在微粒体中表达的蛋白质被脂质双层包裹，并且几乎无法用于任何分析目的。温和的洗涤剂DDM（正十二烷基-β-麦芽糖苷）以温和的方式破坏脂质双层，释放目标蛋白质。膜结合蛋白（如G蛋白偶联受体）在无需对微粒体膜进行去污剂处理的情况下可检测组分。

9. 有没有办法简化从微粒体中回收蛋白质以进行高通量分析？

• 通常，我们建议使用离心步骤将胞质组分与微粒体分离。这确保了胞质溶胶中任何可能的污染都不会干扰进一步的下游加工。然而，在某些情况下，可以跳过该离心步骤，并且通过简单地将温和的洗涤剂DDM（n-十二烷基-β-麦芽糖苷）添加到反应混合物中来实现微粒体中表达的蛋白质的释放。我们建议单独优化每个蛋白质类别的表达条件，以估计这种蛋白质制备方法在下游应用中的产量和纯度之间的权衡。

10. 我可以直接在ALiCE^®反应混合物中分析我的目标蛋白吗？

• 根据您的蛋白质测定所需的纯度和裂解物组分对您的测定评估可能产生的干扰，蛋白质也可以在反应混合物中直接进行分析。在ALiCE^®反应混合物中直接测量G蛋白偶联受体的活性，以及在ALiCE^®反应混合物微粒体中表达的抗体-抗原靶标结合，都有很好的例子。

#蛋白纯化

11. 在您的手册中，您推荐使用洗涤剂DDM来回收微粒体表达的蛋白质，请问可以用8 M尿素代替吗？

• 添加8 M尿素可以最大限度地从微粒体中回收蛋白质，但也会导致靶蛋白变性。为了有效地重新折叠，需要进一步的纯化步骤。联系我们，了解此类实验的更详细解释。

12. 您能否仅从50 μL裂解物中执行蛋白质纯化方案？

• 根据您的下游应用，我们通常建议从至少500 μL裂解物中纯化目标蛋白。可以结合 StrepII 标记蛋白的磁珠（例如，iba Lifescience 的 MagStrep “type3” Strep-Tactin 磁珠）是极少量纯化的最佳选择。

13. 我可以使用His标签纯化ALiCE^®中产生的蛋白质吗？

• 我们的裂解物含有His标记的T7聚合酶。因此，我们建议使用StrepII标签，通过pALiCE01在细胞质中表达您的蛋白质。但是，由于微粒体是一个受保护的环境，不含有T7聚合酶，因此可以使用pALiCE02载体通过HIS标签回收表达的蛋白质。但是，建议采取其他步骤来去除残留的T7聚合酶。这可以通过在继续微粒体制备的正常方案之前，用不含DDM的溶液洗涤沉淀物来实现。

#模板

14.  mRNA可以作为ALiCE^®的模板吗？

• 可以添加 mRNA 作为蛋白质表达的模板，但首先需要进行一些调整。请联系我们的客户支持了解更多详情。

15. 针对大肠杆菌表达进行密码子优化的基因能否在ALiCE^®中表达？

• 密码子优化的优势必须针对每种蛋白质进行单独测试。如果需要优化，应选择烟草作为宿主生物。

#载体与克隆

16.  pALiCE载体是高拷贝数质粒吗？

• 是的，pALiCE01和pALiCE02是高拷贝数质粒。

17. 您通常如何将基因插入pALiCE载体中？

• 目的基因可以由第三方供应商合成并插入到pALiCE01或pALiCE02中，也可以自己扩增并插入载体骨架中。对于后者，我们建议像Gibson克隆一样进行无限制克隆。我们还将各种限制性内切酶识别位点整合到载体中，如果您更喜欢限制性克隆。

18. 您是否推荐pALiCE01和pALiCE02的某些引物序列用于测序目的？

• 为了检查您的目的基因是否正确插入pALiCE01和02的多克隆位点，我们推荐以下引物序列：pALiCE-fw 5′-TCACATGTAATACGACTCACTATAGG-3′、pALiCE-rv 5′-GTACGCACCACGTGTGATTAC-3′。pALiCE-fw在T7启动子区域内结合（该区域可以使用类似的引物序列），pALiCE-rv与TMV-3'UTR 区域结合。

19. 我可以在ALiCE^®中使用来自Miniprep纯化试剂盒的DNA吗？

• 我们首选的质粒DNA制备方法是通过阴离子交换色谱法获得超纯DNA。基于二氧化硅的制备方法可能含有残留的RNase，这会影响ALiCE^®的产量。

20. 我的目标基因入pALiCE所需的限制性内切酶（KpnI、NcoI、NotI）消化，是否有替代载体？

• 我们建议使用Gibson组装克隆或其变体，因为它无需在克隆设置中使用限制性内切酶。从理论上讲，可以使用您自己的载体，但请注意，pALiCE包含目的基因的上游和下游片段，这些片段是在 ALiCE^®中实现最佳表达性能所需的。我们只能为我们自己的载体提供最好的支持。

21. 是否可以将pALiCE02中所含的蜜蜂蜂毒肽信号肽换成不同的信号肽？

• 可以将信号肽序列切换到您选择的序列。但是，我们建议使用pALiCE02载体中存在的蜜蜂蜂毒信号肽（MSP），以便在表达出现问题时提供最佳的客户支持。