ALiCE，ALiCE究竟是谁?

LenioBio有宏伟的愿景。他们希望通过其蛋白质表达平台ALiCE来彻底改变药物成分市场，并生产大量的治疗药物。这一过程是灵活的、快速的，且无需使用细胞。

在2014年和2015年，埃博拉病毒在西非的肆虐程度前所未有。仅在几内亚、利比里亚和塞拉利昂，就有超过1.1万人死亡，另有1.7万名感染者幸存下来。自那以后，卫生当局定期记录到更多的爆发，最近一次是在2022年9月的乌干达。

埃博拉病毒病是一种病毒性出血热疾病，它不仅因为1995年达斯汀·霍夫曼主演的电影《爆发》而声名狼藉。不，埃博拉病毒被是可怕的，它以惊人的效率杀死人类宿主。根据不同的毒株和感染条件，多达十分之九的感染者会死亡。

现在已经有了疫苗，例如减毒的活疫苗rVSV-ZEBOV或者仅具有预防作用的组合疫苗Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo。但在像2014/2015年那样的灾难性爆发中，必须尽快提供有效的治疗药物，因为对大多数感染者来说疫苗没有帮助。

有人感到恼火

一种在西非使用的治疗药物ZMapp，由三个人源化中和抗体组成的组合。事后受到了很多批评。一方面，ZMapp在那时还没有在随机临床试验中进行测试，因此没有在人类身上测试过。另一方面，资金太少，现有的数量优先被美国人和欧洲人使用。

Remberto Martis对此感到不满。2015年，这位生物技术学家在亚琛的Fraunhofer分子生物学和应用生态学研究所（IME）担任商业发展顾问。此前，Martis曾在例如三菱化学、Falcon Technologies和飞利浦等公司工作过。在亚琛，他遇到了一些正在讨论和研究蛋白质表达系统的人。特别是那些不需要活的真核细胞的系统：来自烟草培养的无细胞裂解液。人们也讨论了埃博拉病毒的爆发和ZMapp。因为治疗埃博拉病毒的抗体是在烟草的近亲植物Nicotiana benthamiana中生产的。

这样的生产需要大量的空间和时间。那么，马蒂斯想，为什么不把两者结合起来呢?从那时起，他的想法是在没有细胞的情况下更灵活、更快，从而更便宜的生产药物。在一位商业天使的资助下，Remberto Martis于2016年创立了LenioBio公司。他们的口号是“重新定义生物制药生产”。

三年后，Ricarda Finnern加入了LenioBio团队。“对我来说，我一直认为我所做的必须在医学中有所应用”这位生物技术学家说。因此，在完成学业后，她总是从事与应用紧密相关的工作，无论是与拉沙病毒（Lassa virus）还是在通过噬菌体展示技术进行的抗体开发方面。在美国和瑞士进行了博士后研究以及在亚琛工业大学（RWTH Aachen）获得了初步的项目开发经验后，她离开了学术界，首先加入了美国的生物技术公司Dyax。2008年，她加入了拜耳公司，“从生物技术到大型制药公司”，她回忆说。

"当我在2019年初认识了LenioBio的首席执行官Remberto Martis，他向我介绍了真核系统中的无细胞技术，我很快就清楚了：这就是我想做的，"Finnern说。从那时起，她与Martis以及财务负责人Franziska Grabenkamp一起，作为首席科学官成为LenioBio管理团队的一部分。2022年初，Jasper Levink作为首席商务官也加入了团队。

2019年还看不到那些宏伟愿景。当Finnern加入LenioBio时，这家初创公司在亚琛的Fraunhofer IME以最小的团队规模工作。但据Finnern说，这完全是有意为之。2018年，团队就已经将ALiCE作为一个无细胞蛋白质表达的研究工具包推向市场，因为Martis当时说：“如果我想建立一种尚不存在的技术，我必须首先为其创造知名度。”这表明LenioBio：该系统有效且效果良好！

烟草细胞作为特殊技巧

ALiCE带来了预期的知名度和Finnern所说的“收入”。仅在2019年，LenioBio就与Merck Millipore Sigma签署了该工具包的分销协议，完成了超过四百万欧的A轮融资，并获得了欧盟Horizon 2020计划的支持。次年，这家来自杜塞尔多夫的公司与Fraunhofer IME一起获得了德国联邦教育和研究部的支持，2021年，他们将A轮融资增加了1150万欧元。

公司随着资金注入发展壮大。从最初的3名员工，2019年增加到8人，在公司成立五周年时已经达到了35人。今天，LenioBio有60名员工，并且他们正逐步接近最初的愿景。

但ALiCE到底是什么？ALiCE代表“Almost Living Cell-free Expression”，即一种无细胞的蛋白质表达系统。其独特之处在于：它是由植物细胞制成的，更具体地说，是由烟草细胞制成的。ALiCE最初作为BYL（烟草细胞系BY-2的裂解液）由Fraunhofer IME和美国农业公司Corteva Agriscience开发。LenioBio在2018年初独家获得了这项技术的使用权，并从那时起一直在优化它。

为了获得裂解液，杜塞尔多夫的团队在生物反应器中培养烟草细胞直到达到所需的密度。然后通过酶去除植物细胞壁，以及任何蛋白质表达不需要的东西。这就是为什么称之为“Almost Living”，因为该系统缺少通常对生命至关重要的组分，比如细胞核。最后，他们溶解细胞膜。剩下的是包含核糖体、翻译因子、氨基酸和tRNA的混合物。为了启动反应，LenioBio的开发者还添加了缓冲液、T7聚合酶和核苷酸。由于活性线粒体已经存在于裂解液中，Finnern解释说，一些ATP和GTP形式的简单能量助推器就足以生产蛋白质。其余的工作由细胞自身的能量机器完成。

这几乎是全部了。当然，ALiCE仍然需要一个蓝图。这个蓝图以编码目标蛋白的DNA序列的形式出现。然后ALiCE就开始工作，48h后（如果接受较少的产出也可以更早）用户就可以收获他们所需的蛋白。

在这48h内，一升ALiCE裂解液可以生产多达3g的蛋白质，Finnern说。这在传统的细胞培养系统中是无法实现的。此外，每一种蛋白质表达必须创建自己的细胞系。ALiCE则不同：“无论是抗体还是类病毒颗粒，系统不在乎它处理的DNA是什么。ALiCE只生产蛋白质。”

因此无细胞系统可以制造那些让细胞感到“绝望”的蛋白质；例如，那些对活细胞有毒的蛋白质，或者是生长因子，如果数量足够，也会把细胞推向绝望的边缘。或者是像G蛋白偶联受体这样的复杂功能性跨膜蛋白，这些蛋白让细胞生物学家和细胞都感到棘手。但这些都不是问题。

因为ALiCE与活细胞不同，它是一个灵活的开放系统：添加分子伴侣以确保目标蛋白正确折叠？可以做到。同时添加五个质粒和一些人工氨基酸来表达一个修饰的蛋白质复合物？有些棘手，但可以做到。或者直接在裂解液中进行化学修饰？当然可以。听起来像一个魔法工具箱，它也确实如此。

在“最终产品”中，真核原始细胞的另一个优势显现出来。“我们的系统中也包含微粒体，”Finnern说。“在制造裂解液时，我们虽然去除了外细胞膜，但高尔基体和内质网保持完整。”这些现在形成了在裂解液中游动的小膜岛，即内质网体，它们确保翻译的蛋白质被修饰。Finnern说，原核无细胞系统无法做到这一点。“我们知道磷酸化正在发生，并且我们目前正在研究N-糖基化。”

工具箱不是简单的工具包

植物糖基化用于之后应在人类中使用的有效成分？有一种名为木糖（Xylose）的糖，在人体中自然不会出现；还有一种名为岩藻糖（Fucose）的糖，在植物细胞中的结合方式与在人类细胞中不同。Finnern说。现有的少数研究表明，这样的植物特异性的翻译后修饰在潜在活性成分上，即使在人类应用中也不会构成问题。“但我们当然总是考虑这些问题，”这位生物技术学家补充道。

因此，LenioBio不仅使用野生型烟草细胞系，还使用一种敲除细胞系，这种细胞系不会将这些糖附加到蛋白质上。同时，岩藻糖对于激活免疫系统也很重要，在某些条件下（例如在抗体）是非常需要的。Finnern总结道：“因此，ALiCE不仅仅是一个工具包，而是一个平台，一个合成生物学的工具箱，我们可以根据需要制造和修改，甚至是优化分子。”

让我们回到愿景。因为无细胞蛋白质表达并不是LenioBio或Fraunhofer IME的新发明。其他公司也已经在使用和销售这项技术。但迄今为止，规模一直是个问题，扩大规模正是为了能够生产大量有效成分和治疗药物所必需的。

每天30g蛋白质

为了实现这一目标，需要进行一些创新思维，因为之前没有人用真核细胞做过这样的事情，Finnern说。于是LenioBio的开发者们研究了市场上已有的设备和技术，并对其进行了调整。他们成功了。在2022年7月，杜塞尔多夫的团队宣布，他们能够一次性从500L细胞培养液中制造出10L裂解液。“而且我们知道，用一升裂解液我们每天可以生产3g蛋白质，”Finnern说。剩下的每个人都可以计算出来。下一个目标是什么？100L裂解液。以此类推。

这明显更接近于最初的目标，即简化生产并加快向患者提供药物。这样也为一个新的客户领域打开了大门，这个领域可能已经迫不及待地想要尝试了。因为虽然到目前为止，该工具包一直为学术实验室以及研究性的生物技术和制药行业提供无细胞生产的蛋白质，但对于大量精确设计和制造的蛋白质，药物开发公司肯定特别感兴趣。完全符合“重新定义生物制药制造”的座右铭。

图1 ALiCE的无细胞蛋白表达

图2  LenioBio团队

注：LenioBio的领导团队（左图为Franziska Grabenkamp（首席财务官，左一），Remberto Martis（首席执行官，中间）和Ricarda Finnern（首席科学官，右一））以及整个团队在五周年庆典上（上图）。到目前为止，团队已经扩展到超过60人。